肿瘤免疫微环境研究之肿瘤抗原发现对外显子

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分析背景其明公司长达1年的准备，开发出了面向肿瘤免疫微环境的肿瘤抗原MHC复合物产品。由于相关产品上千种，究竟选择哪种肿瘤抗原作为淋巴细胞的激活物和流式分选四聚体呢？其中关键点是肿瘤抗原的检测平台——肿瘤全基因外显子测序的技术平台选择问题。为了解答这一问题，我们整理了从年至年以来顶级期刊发表的肿瘤抗原相关外显子测序深度信息、是否需要配对样本的问题。由于其明公司的GCBI-MAS系统已完成25万份肿瘤外显子测序分析，该系统覆盖肿瘤抗原+HLA结合模式分析。经过十万例以上数据验证，我们推荐如下论文所代表的分析方法。代表性论文mRNAvaccine–inducedneoantigen-specificTcellimmunityinpatientswithgastrointestinalcancer.年JCI

代表性段落“tumorandnormalcoverageof10orgreater,atumorvariantreadcountof4orhigher,atumorvariantfrequencyof7%orhigher,and2ormorecallerscallingthevariant”,也就是肿瘤和正常样本大于10层即可，需配对血样，作为胚系变异的参比，用于发现真正的体细胞突变。

Integratedproteogenomicdeepsequencingandanalyticsaccuratelyidentifynon-canonicalpeptidesintumorimmunopeptidomes.NatureCommunication

代表性段落“Atleast70xcoveragewasrequiredforthemelanomacelllinesandPBMCs/TILs.Fortumor/normallungtissues,atleastxcoveragewasrequired".细胞系测序为70层覆盖，肿瘤和正常组织测序为层覆盖。

Neoantigenidentificationstrategiesenablepersonalizedimmunotherapyinrefractorysolidtumors.年JCI

代表性段落“Inbrief,aftersamplepreparation,DNAextraction,andlibrarypreparation,theenrichedlibrariesweresequencedonHiSeqNGSplatforms(Illumina)withcoveragedepthsofatleast×,×,and0×afterremovalofPCRduplicatesforblood,FFPE/pleuraleffusion,andctDNA,respectively.”血液标本层，冰冻肿瘤组织标本层，ctDNA0层，需配对血样，作为胚系变异的参比，用于发现真正的体细胞突变。

SensitiveDetectionandAnalysisofNeoantigen-SpecificTCellPopulationsfromTumorsandBlood.年CellRep

代表性段落“Paired-end2×bpsequencingwascarriedoutontheHiSeqplatform(Illumina,SanDiego,CA)followingexoncaptureusingtheNimblegenSeqCapEZHumanExomeLibraryv3.0(Roche),whichtargets65Mbofgenome.Eachtargetedbasewascoveredbyanaverageof90–reads."肿瘤样本每个碱基层，需配对血样，作为胚系变异的参比，用于发现真正的体细胞突变。

Identificationofuniqueneoantigenqualitiesinlongtermpancreaticcancersurvivors.年Nature

代表性段落“PairedEnd/,usingtheTruSeqSBSKitv3(Illumina)withatargetcoverageofXfortumorsamplesand70Xformatchednormal(MSKCCCenterforMolecularOncology).”正常样本70层，肿瘤样本层。

Immunogenicityofsomaticmutationsinhumangastrointestinalcancers.年Science

代表性段落“Forpatient,whole-genomesequencing(WGS)wasperformedusingtheIlluminaHiSeqwithanaveragedepthof39.19forthenormalsampleand46.53forthetumorsample.”正常样本40层，肿瘤样本45层。

MiningExomicSequencingDatatoIdentifyMutatedAntigensRecognizedbyAdoptivelyTransferredTumor-reactiveTcells.年NatMed

代表性段落“Over43millionbasesoftargetDNAwereanalyzedinthetumorandnormalsamples,andanaverageof42to51readswereobtainedateachbaseinthenormalandtumorDNAsamples.”也就是说肿瘤组织测50层左右，需配对血样，作为胚系变异的参比，用于发现真正的体细胞突变。

总结分析

在肿瘤免疫微环境的肿瘤抗原分析部分，为了发现肿瘤抗原而进行的外显子测序，必须要同时检测肿瘤组织和正常组织，正常组织也可以用外周血样本替代。其目的是用正常或外周血组织作为胚系变异的参比，这些胚系变异将从肿瘤变异位点列表中剔除。

关于测序深度的问题，不同的文章答案不一，其主要决定因素是测序成本问题。如果使用IlluminaHiseq测序仪，肿瘤标本测序深度普遍不会超过层。若使用更高通量的Hiseq甚至Xten、Novoseq测序仪，或者BGI测序仪，肿瘤标本的测序深度将超过层。总之，相同的标本，随着测序仪的测序通量越大，测序单价越低的情况下，测序深度越深。

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