CD8T细胞亚群在肿瘤微环境和抑制肿瘤

生长侵袭的肿瘤发展出多种细胞和分子来逃避和/或抵抗免疫攻击，这些机制被称为适应性免疫抵抗。其原型是肿瘤微环境(TME)中B7-H1(PD-L1)的上调，这主要是由肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)分泌IFNγ诱导的。这些机制通常会导致TIL的排斥或功能受损，从而限制内源性抗肿瘤免疫反应。如阻断PD-1/B7-H1通路(以下称为抗PD疗法)等策略在纠正和修复受损的T细胞对癌症的反应，这种方法被称为标准化癌症免疫疗法。然而，如CD8+T细胞功能失调的具体机制或抗PD治疗如何克服这种功能障碍等基本问题仍未得到解答。

研究方法

这项研究中，使用多层方法和正交互补分析平台，包括单细胞流式细胞术(CyTOF)、定量免疫荧光(QIF)，逐步解剖非小细胞肺癌(NSCLC)患者的CD8+TIL区室。IMC和RNA测序(RNA-seq)，以研究功能失调的人类T细胞的性质和特征。此外，开发了一种人源化PDX模型(此处称为免疫PDX)，可以通过实验调节和分析完整的患者来源的肿瘤浸润淋巴细胞。研究揭示了一个明显功能失调的CD8+TIL亚群，它以PD途径依赖的方式在TME内扩展。这CD8+TIL亚群显示出终末期分化的标志物，在刺激后产生较低的IFNγ，并显示出增加的细胞凋亡，但也具有高度增殖性。最后，证明了这种CD8+TIL亚群在更晚期的NSCLC患者中积累，其积累越高，抗PD治疗的临床反应越差。

研究结果

1.免疫分析显示CD8+TILs在NSCLCTME中增殖

从25名可切除的NSCLC患者中获得了手术切除的肿瘤和非肿瘤配对肺组织。样本被分成两个部分，并进行基于蛋白质组学的多参数CyTOF和QIF分析。使用未刺激与刺激的人PBMC对识别诱导标记的抗体进行严格验证。根据特定谱系标志物的差异表达定义了主要免疫细胞群，发现CyTOF在Tu组织中所有淋巴亚群均显著增加。非淋巴样亚群在TME中显得不突出，并且Tu组织中淋巴样细胞与非淋巴样细胞的总体比率显得更高。此外，CD8+TIL的增殖能力(Ki-67+)明显高于非TuCD8+T细胞。这些数据表明CD8+TIL在NSCLC患者的TME内扩展，是增殖能力最强的TIL部分。

2.增殖性、终末分化的CD8+TIL亚群在TME中选择性扩展

采用名为CITRUS的无监督分层聚类方法，根据表型标志物的表达谱对来自Tu和非Tu肺组织的2.1×CD3+T细胞进行分层。CITRUS自动将CD4+和CD8+分支中的组织浸润CD3+T细胞分层。随后，CD8+T细胞被分成两个主要的效应细胞群和效应记忆细胞，表明这两个CD8+亚群在肺组织浸润中占主导地位。EM群体进一步细分为两个亚群。一个显示了传统的效应记忆表型，称为效应记忆(Em)细胞。另一个的特征是CD45RO、EOMES、FAS、CD27、CD28、KLRG1、PD-1、LAG3和TIM3高表达。该特征与激活的、终末分化的和促凋亡的表型一致，此处称为Ebo细胞。

3.EboCD8+TILs是一个转录不同且功能失调的亚群

为了进一步探索了这些细胞的转录和功能特征，文章对三个CD8+TIL亚群通过流式细胞术进行分类并处理用于全转录组RNA-seq分析。Ebo与Em相比与EffCD8+TIL显示出更大的转录相似性。Ebo具有更高的表达与细胞增殖相关的其他转录物，Em显示出与组织发育和细胞分化相关的基因表达上调。基因集富集分析(GSEA)显示Ebo种群中富集的增殖特征，而Em种群显示干细胞类型特征的富集。此外，分析了来自三个亚群的T细胞受体(TCR)测序转录本，并观察到EffCD8+TILs显示出最高的克隆性，而Ebo和Em显示出更高的克隆型多样性。CD8+TIL亚群通过流式细胞术从九个原发性NSCLC组织中分选，并在体外PMA-离子霉素刺激后分析细胞内IFNγ表达。Ebo细胞显示出最高的增殖和激活标志物基线表达，但与Em和Eff细胞群相比，它们产生的IFNγ量最少。三个CD8+TIL亚群在转录上是不同的，表明Ebo亚群富含凋亡和功能失调的CD8+T细胞。

4.B7-H1/PD-1通路介导TME内的EboCD8+TIL扩增

为了探索TME内CD8+TIL亚群的动态变化及其对免疫治疗的反应，开发了一个免疫熟练的PDX模型。使用皮下移植到NOD/SCIDIL2Rγ-/-(NSG)小鼠中的4-5mm新鲜原发性NSCLC手术标本。异种移植物包含患者独特TME的所有人类成分。观察到CD8+CD4+B、自然杀伤T和髓系单核吞噬细胞的细胞组成在植入后至少2周内保持不变，自然杀伤细胞和粒细胞在同一时间段内显著下降。在基线和CyTOF植入后2周监测了TME内三个CD8+TIL亚群的丰度，发现Ebo显著增加,CD8+TILs随时间逐渐减少。为了测试抗PD疗法对CD8+TIL群体的影响，用avelumab(抗人B7-H1mAb)或同种型对照治疗了移植了B7-H1+肿瘤的免疫PDX。CD8+TIL亚群在两个剂量的治疗后通过CyTOF进行评估。avelumab降低了Eff细胞中促凋亡标志物(BIM)的表达，并增加了激活标志物CD27和CD69的水平。结果表明，B7-H1/PD-1阻断可能在激活过程中对该群体起到保护作用。在Eff和Em中，B7-H1阻断后TBET显著增加。EboCD8+随着时间的推移，TIL亚群在TME内扩展，并且这种扩展可以通过B7-H1来减少。

5.Ebo丰度与肿瘤进展和抗PD治疗耐药有关

观察到Ebo随着时间的推移在人类TME内扩张，推测这种功能失调的CD8+T细胞群的扩张可能与疾病进展相关。在晚期NSCLC病例肿瘤样本中，抗PD治疗具有非持久临床获益(NDB)的患者的EboCD8+TIL亚群比例显著高于具有持久临床获益(DCB)的患者。NDB患者表现出CD8+TILs具有更高的PD-1、LAG3和Ki-67表达，这些标志物与EboCD8+TIL表型相关。在接受抗PD治疗的NSCLC患者中，EboCD8+TIL亚群丰度与较差的总生存期相关。包括PD-L1表达作为变量分析确定了EboCD8+TIL丰度作为结果的独立预测因子。研究结果支持Ebo在晚期NSCLC患者的TME中扩大的观点，其扩大与抗PD治疗的疗效降低独立相关。

研究结论

研究通过流式细胞术对三个CD8+TIL亚集进行分类，并进行整个转录组RNA-seq分析。利用定量免疫荧光及免疫PDX等方法统计相关数据说明了未被认识的一类抗PD耐药T细胞炎症肿瘤。与预期相反，抵抗的潜在机制可能是功能失调的活化TIL过多。这项研究可能有助于更深入地了解T细胞的肿瘤多样性，而Ebo可能作为一种有意义生物标志物，对未来基于T细胞的癌症免疫疗法的发展产生影响。

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