实体肿瘤单细胞悬液评估方法与制备的注意事

评估制备的单细胞悬液

评估实体组织制备的单细胞悬液好坏的三个关键的参数：(1)细胞活力；(2)细胞碎片；(3)细胞聚集物。

细胞活力

细胞活力评估方法：台盼蓝染色法、流式细胞术法。

台盼蓝（Trypan?Blue)?是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性，还常用于检测细胞是否存活。活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。

流式细胞术法：主要通过一些核染料如7AAD、PI对单细胞悬液进行染色，或者通过Annexinv与核染料共染色，然后通过流式细胞术检测，阳性细胞为死细胞或凋亡细胞，阴性细胞为活性细胞如图。

细胞碎片与细胞聚集物

细胞碎片与细胞聚集物评估方法：光学显微镜直接观察的方法或流式细胞术法。通过光学显微镜，我们可以直接可以看出细胞的聚集体及细胞碎片的多少。通过流式细胞术的FSC/SSC及其FSC-W/SSC-W/FSC-H/FSC-A等判断细胞碎片及细胞聚集体如图通过散点图FSC/SSC散点图中的P8门去除状态不好细胞或碎片，P1门是我们的目标细胞亚群，通过FSC/SSC的H或者W去除双链体。

细胞碎片或死细胞过多则会影响目标群体中的检测，如下图同一样本不同电压流式检测结果的FSC/SSC图。图1，由于碎片或死细胞过多，该部分信号完全掩盖了真正目标群体的信号，因此未找到目标群体(P1门里的细胞)。图2，目标群体太少，当我们记录的数据达不到一定的数量时，想找到目标群体也很难。图3，当我们记录足够量的细胞的时候，目标群体显示出来。图4，当我们把电压调到一个合适的位置时，目标群体很快找出.

解决方法：（1）核染料法如上图（凋亡图）；（2）试剂盒法：主要原理是使用微球或特异性结合的缓冲液磁性标记细胞碎片、死细胞或者锤死细胞，然后通过过柱子对不需要的细胞进行负选择。

实体瘤制备单细胞悬液的注意事项

一、酶的反应温度

酶的反应温度：每一种酶都有自己的最适的反应温度，温度过高或过低都会抑制酶的活性。酶与样本的孵育时间对于单细胞悬液制备的质量至关重要，孵育时间不够，则聚集物与细胞团块增加。孵育时间过长，则细胞活力降低、细胞碎片与细胞团块增加。

二、酶解反应过程中，应将组织放在一种轻柔的混匀器上，帮助细胞从细胞外基质中释放出来。

三、当提取的单细胞悬液中具有过多的红细胞时，应该对单细胞悬液进行裂红。

四、缓慢冷冻或快速冷冻方法冷冻解剖组织获得的单细胞悬液，总的细胞得率降低。

五、组织匀浆器是一种强力的机械分离方法，它不适用于分离单细胞悬液。因为它在匀浆的过程中容易产生细胞和组织的肉汤。组织匀浆器代替切割组织会导致细胞产量和活力下降。细胞碎片和碎片相对数量的减少是整个方案中发生的离心作用的结果。

六、振荡器涡旋细胞是一种强有力的细胞处理方法，为了保持细胞活性不建议用振荡器涡旋。建议用移液器温软的操作。同时，注意不要产生气泡。

七、离心机对细胞悬液离心分离可能导致固体组织获取的单细胞悬浮液的产生不良结果。细胞应在至相对离心力（RCF）离心，RCF更适合固定细胞离心，较低的力值用于活的、未固定的细胞。每分钟转数（rpm）取决于每个特定离心机转子半径的可变力，以太高的速度离心细胞会导致紧凑的颗粒和细胞膜的损坏，而以太低的速度离心将使细胞保持悬浮状态，并在上清液被吸入时丢失。

八、为了保持细胞活力，未固定的细胞应该放在冰上染色，避免在免疫染色的过程中细胞死亡。

九、整个的消化过程中缓冲液都应加入DNA酶，降解裂解细胞释放的DNA，防止细胞聚集。

十、为了防止细胞聚集，缓冲液中应加入EDTA。EDTA是一种螯合剂，可以结合二价金属离子，防止整合素介导的细胞粘附与细胞外基质中。消化混合物中加入EDTA对于限制上皮细胞和巨噬细胞等自然粘附细胞的粘附很重要。

参考文献

Leelatian,N.,Doxie,D.B.,Greenplate,A.R.,Sinnaeve,J.,Ihrie,R.A.Irish,J.M.().Preparingviablesinglecellsfromhumantissueandtumorsforcytomicanalysis.CurrentProtocolsinMolecularBiology,,25C.1.1–25C.1.23.doi:10./cpmb.37

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