肿瘤相关成纤维细胞中HIC5促进食管鳞

摘要

食管鳞状细胞癌（ESCC）是中国最常见的恶性肿瘤之一，转移率高，预后差。肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境的重要组成部分，可以影响肿瘤的进展和转移，但其潜在机制仍不清楚。本研究发现，过氧化氢诱导克隆5（hydrogenperoxide-inducibleclone5,HIC-5）在ESCC患者肿瘤基质的CAF中高表达，从ESCC患者组织中分离出CAFs和NFs，CAFs中的HIC-5敲除抑制了ESCC细胞的迁移和侵袭。TGF-β刺激后CAF的上清液CCL2水平显著升高，而敲除HIC-5后CAF的上清CCL2水平显著降低。CAF中HIC-5的抑制可导致ESCC细胞与CAF混合移植瘤表现出更规则的形态，CDH1表达升高、CCL2表达降低。进一步的RNA-seq数据显示，HIC-5在CAFs与NFs中具有独特的生物学功能，尤其是在细胞运动和Rho激酶途径中，这一点已通过划痕实验和Westernblotting证实。ESCC组织微阵列显示，肿瘤基质中HIC-5表达升高与淋巴结转移和TNM分期呈正相关。总之，基质HIC-5是ESCC淋巴结转移的危险因素，而CAF衍生的HIC-5可通过调节细胞因子和修饰ECM来调节ESCC细胞的迁移和侵袭。

介绍

食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率和死亡率排名分别为第7位和第6位，并且其5年相对生存率在所有癌症中排名第三。中国是食管癌发病率和死亡率最高的国家之一，每年报告死亡37.5万例。食管腺癌（EAC）和食管鳞状细胞癌（ESCC）是两种主要的食管癌亚型，ESCC占中国所有病例的88.84％，而在西方国家EAC更为常见。多数新诊断食管癌病例为晚期转移性，导致食管癌5年生存率极低，即使是在T1期ESCC患者中，淋巴结转移和复发率也从0％到62％不等。研究ESCC进展转移的分子机制并鉴定其生物标志物将为开发靶向疗法提供新的见解，指导临床治疗，改善ESCC患者预后。

肿瘤微环境（TME）是导致癌症进展和转移的重要因素。TME，也称为肿瘤基质，由免疫细胞，毛细血管，基底膜，活化的成纤维细胞和癌细胞周围的细胞外基质（ECM）组成。随着肿瘤细胞和基质细胞的共同进化，TME可以转化为致病状态，加速肿瘤细胞的入侵，并为远端迁移创造环境。作为TME的重要组成部分，癌症相关的成纤维细胞（CAF）在肿瘤的进展和转移中扮演着复杂的角色。CAF可释放细胞因子和生长因子到ECM以及体液循环中来促进肿瘤远端转移，ECM重塑和CAF代谢重编程也有助于与肿瘤细胞共生。

过氧化氢诱导的克隆5（HIC-5），也称为转化生长因子β-1诱导的转录本1（TGFβ11i1），由H2O2和TGF-β1诱导生成，是PAXILLIN的近亲家族成员，是一种在氧化剂的刺激下在粘着斑和细胞核之间穿梭的粘着斑蛋白。HIC-5在人体组织的血管和内脏平滑肌细胞中高表达，有助于调节细胞的收缩能力和肌肉分化。如先前对乳腺癌，前列腺癌，肝细胞癌和黑色素瘤的研究所示，在肿瘤细胞中高表达的HIC-5可增强肿瘤的侵袭和迁移能力。最近的研究也注意到了HIC-5在成纤维细胞及其与肿瘤细胞交互作用中的功能，CAF中表达的HIC-5通过ECM重塑和细胞因子分泌促进乳腺癌和前列腺癌的侵袭和迁移，并且是导致大肠癌肿瘤发生的原因。但CAF衍生的HIC-5如何调节肿瘤进展的机制仍不清楚。此外，尚无研究探讨HIC-5在ESCC中的作用或比较HIC-5在CAF和正常食管成纤维细胞中的作用。

在本研究中，首先检测了ESCC中HIC-5的表达，然后，从ESCC组织中分离出CAFs，比较了HIC-5在CAFs和正常食管成纤维细胞中的作用，探讨了HIC-5在CAFs中的作用及其对ESCC肿瘤细胞的作用，并研究了HIC-5促成ESCC进展的可能机制。

结果

1.HIC-5在ESCC肿瘤基质CAF中高表达

aESCC肿瘤组织和附近基质中HE染色和HIC-5免疫组化染色图片。红色箭头代表肿瘤基质。b根据免疫荧光分析，在ESCC组织和邻近基质中αSMA和HIC-5的细胞共定位。c根据αSMA，FN1和波形蛋白的免疫荧光染色鉴定从肿瘤组织和基质细胞中分离的CAF及其配对的NF。d通过qRT-PCR检测CAF，NF，KYSE和TE1细胞中HIC-5的相对mRNA表达。eWesternblot分析NF和CAF中HIC-5、αSMA和FN1表达情况。f免疫组化检测80对ESCC组织和邻近基质中HIC-5表达情况。g食管鳞状细胞转移癌和非转移性癌免疫组化HIC-5染色。红色星号代表肿瘤基质。

2.基质HIC-5表达与ESCC淋巴结转移有关

免疫组化评估食管癌基质和癌旁组织基质中HIC-5的表达水平，ESCC组织芯片结果显示，肿瘤基质中HIC-5的表达水平高于正常组织基质中的HIC-5表达水平。对例ESCC病例的Kaplan-Meier生存分析表明，在基质中HIC-5表达不同的患者，生存率没有显著差异。但是，在CAF中，HIC-5在转移性癌组织中的表达强于在非转移性癌组织中的表达。因此，推测CAF衍生的HIC-5可能与ESCC转移相关。进一步统计分析表明，肿瘤基质中基质HIC-5表达升高与淋巴结转移和TNM分期呈正相关，与其他临床病理参数无关。此外，单因素分析显示淋巴结转移与性别，分化和基质HIC-5表达相关。根据多因素Logistic回归分析，男性、中低分化和基质中HIC-5高表达是淋巴结转移的独立危险因素。这些分析表明，CAF中HIC-5表达与ESCC淋巴结转移有关。

3.CAF中的HIC-5促进ESCC细胞迁移和侵袭

a用siRNA敲除HIC-5后，分别通过qRT-PCR和Westernblotting检测的CAF中HIC-5的mRNA和蛋白表达水平。b间接共培养体系图。cMatrigel中直接三维共培养体系图。d与HIC-5敲除的CAFs共培养时，KYSE和TE1细胞迁移情况。e与HIC-5敲除的CAFs共培养时，KYSE和TE1侵袭情况。f与CAF-siNC或CAF-siHIC-5共培养的KYSE/TE1细胞形态。黑色箭头代表肿瘤细胞集落。红色箭头表示多个克隆形成的集落。

4.CAF衍生的HIC-5通过调节细胞因子和修饰ECM促进肿瘤进展

a三例不同的CAF中HIC-5敲除后上调和下调的基因。b根据差异基因进行KEGG通路分析，气泡图代表显著富集的通路。cCAF-siHIC-5与对照CAF之间不同主要途径中基因的log2倍变化热图。d通过EdU检测CAF增殖情况，并定量分析EdU阳性细胞（％）。e根据RNA-seq数据选择的差异表达的细胞因子/受体或ECM组分及其mRNA表达水平。fELISA定量分析检测TGF-β刺激后的上清液中CCL2水平。

5.CAF中HIC-5的敲除对ESCC细胞与CAFs混合移植瘤的影响

a通过qRT-PCR和Westernblotting证实CAF中由慢病毒介导的shRNA对HIC-5的成功敲除。bHIC-5敲除的CAF或对照CAF与KYSE细胞的裸鼠混合移植瘤的肿瘤体积。c裸鼠混合移植瘤的肿瘤重量。d裸鼠混合移植瘤的瘤体。红色箭头表示出芽的肿瘤组织。eHE染色，HIC-5和αSMA免疫组化染色。红色箭头代表CAF。fKYSE+CAF-shNC和KYSE+CAF-shHIC-5肿瘤组织中迁移相关基因的mRNA表达水平。

6.HIC-5在CAF和NFs中具有独特的生物学功能，尤其是在细胞运动与Rho激酶信号传导途径中

a划痕实验表明，CAFs比NFs迁移率更高，HIC-5的敲除促进了CAFs迁移，但对NFs却没有促进作用。bTranswell实验表明，CAFs比NFs迁移率更高，HIC-5的敲除促进了CAFs迁移，但对NFs却没有促进作用。右侧面板中显示了细胞迁移的定量分析。cCAF中的HIC-5敲除大大增强了F-肌动蛋白的表达。d将CAF-siHIC-5与对照CAF进行RNA-seq分析比较，检出67个上调基因与66个下调基因，右图：虚线上方的mRNA表达表明，敲除HIC-5后，CAFs比NFs明显上调。虚线下方的mRNA表达表明，HIC-5敲除后，CAFs比NFs明显下调。这些基因与Rho激酶信号传导途径和细胞运动相关。

7.HIC-5对CAFs和NFs中的TGF-β信号转导通路和Rho激酶信号传导途径具有显著影响

a,b在CAF和NF中，TGF-β处理后，SMAD2和SMAD3的磷酸化均显著增强，但在CAF中，SMAD2和SMAD3磷酸化增强的方式存在差异：与CAF-siNC相比，CAFs-siHIC-5的SMAD2磷酸化增加更为显著。相反，HIC-5的敲除逆转了SMAD3磷酸化的增强，而在NFs中，无论是否敲除HIC-5，SMAD2/3磷酸化的变化都相同。c,dWesternblotting检测TGF-β处理24小时和48小时后HIC-5和RAC1的表达，结果表明无论HIC-5是否敲除，CAF和NF中HIC-5的水平都会增强。CAF-siHIC-5中的RAC1表达显著高于对照CAF中的表达，但在NF组之间没有差异。所有这些发现表明，HIC-5对CAF和NF中的TGF-β信号转导和Rho激酶信号转导通路具有显著影响。

本研究证明了源自CAF的HIC-5促进了ESCC细胞的迁移和侵袭，又通过组织芯片证实了肿瘤基质中HIC-5表达的增强是淋巴结转移的独立危险因素，mRNA表达数据和异种移植肿瘤形态表明，CAF衍生的HIC-5导致了肿瘤转移的趋势。

TGF-β是公认的介导NFs向CAFs表型转换、促进成纤维细胞增殖、募集和侵袭的关键分子。作为TGF-β信号通路的关键分子，磷酸化的SMAD2和SMAD3转位入核，并与其他核辅助因子一起调节靶基因。SMAD2可促进TGF-β1诱导的生长抑制，而SMAD3抑制生长抑制和迁移反应。此外，SMAD2的耗竭增强SMAD3的活性，反之亦然，两分子之间存在动态平衡，以调节细胞活动。本研究发现，当HIC-5在CAFs中被敲除时，SMAD2磷酸化增加，SMAD3磷酸化减少，而SMAD2/3磷酸化在NFs中没有显著差异，结果表明，HIC-5通过TGF-β/SMAD信号传导阻碍了CAFs的运动。

RAC1是RhoGTPase家族的重要成员，它参与包括细胞周期，细胞骨架重塑，细胞运动和细胞粘附等许多细胞生理活动。癌细胞中RAC1的过表达会诱导层状脂膜形成并促进细胞运动异常，导致上皮-间质转化（EMT）。HIC-5在调节上皮细胞和基质细胞中的RAC1活性中起着双重作用。本研究发现，与对照CAF相比，CAF-siHIC-5中RAC1显著上调，但在两NF组之间几乎没有差异。该发现与TGF-β/SMAD信号转导的改变是一致的，这表明HIC-5可以抑制CAF的运动且在CAF和NF中具有不同的功能。

根据RNA-seq分析，敲除CAF中的HIC-5可改变包括FoxO信号通路和AMPK信号通路在内的代谢途径，这表明HIC-5可能通过影响代谢物的产生而参与CAF与癌细胞之间的交互作用。另一方面，CAF衍生的HIC-5可增强细胞因子（如CCL2）的分泌，从而刺激糖酵解，通过调节代谢信号传导途径并促进炎症状态，CAF衍生的HIC-5可通过上调CAF糖酵解作用为癌细胞提供能量，从而加速肿瘤进展。

RNA-seq分析和细胞功能实验均表明，HIC-5具有与细胞运动有关的功能。HIC-5会减弱CAF的运动，从而限制其包围癌细胞从而限制癌症的迁移的能力。当HIC-5敲除时，NF没有显示出细胞运动能力的显著变化，这可能是由于在没有癌细胞刺激的情况下它们的静止状态所致。有趣的是，TGF-β诱导了NFs核中HIC-5的显著积累，但未诱导CAFs中的积累。作为粘着斑和细胞核之间的穿梭者，HIC-5将信号从细胞质传递到细胞核。HIC-5在NFs中的核积累而在CAFs中没有，这可能说明核内HIC-5转导信号从而为早期肿瘤的发生奠定基础，而胞质中的HIC-5主要促进癌症的进展。

本研究还探讨了HIC-5在实质细胞中的作用，其表达明显低于基质中的表达，HIC-5增强了癌细胞的增殖，但减少了KYSE细胞的迁移和侵袭。这些结果与以前的研究不一致，有研究报告说，HIC-5增强了乳腺癌和前列腺癌细胞的EMT，以及促进乳腺癌和肝癌的转移。在本研究的组织芯片结果中，没有显示出HIC-5在ESCC细胞中的表达和癌症进展之间的相关性，这表明HIC-5主要通过CAFs的介质促进ESCC的进展，这些差异也可能与肿瘤的异质性有关。

总之，本研究表明，基质HIC-5是人类ESCC淋巴结转移的预测因素，而CAF衍生的HIC-5通过调节细胞因子和修饰ECM来调节ESCC细胞的迁移和侵袭。这些发现为进一步了解HIC-5调节细胞因子并将CAF衍生的HIC-5作为潜在治疗靶点的机制提供了理论基础。

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