揭示癌细胞对不同肿瘤抑制剂产生耐药的进化
研究背景
肺癌在早期阶段，是很难被检测到的，而且这种癌症也很难治疗。因此，它是世界癌症死亡的主要原因，每年估计有万人死亡，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占85%，肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)是最常见的亚型。间变性淋巴瘤激酶(ALK)和EGFR一样属于受体型酪氨酸激酶，NSCLC患者中发生ALK融合约占3-5%。最常见的是EML4-ALK融合，根据断裂位点不同，有21种不同的EML4-ALK融合形式。目前，NCCN指南已推荐阿雷替尼，色瑞替尼用于ALK融合阳性患者的一线治疗方案。但目前市面上的药物在使用10-12月左右通常都会面临耐药的情况，因此探究癌细胞产生耐药的进化机制并根据机制针对性的开发新型药物已经成了一个急需解决的问题。
Result1不同的ALK-TKIs选择不同的抗性表型
作者首先从了解TKIs的耐药性演变出发，选择了ALK+NSCLC细胞系NCI-H进行研究，通过剂量递增方案对耐药性细胞筛选出不同ALK-TKIs的耐药浓度（图A），发现对ALK-TKI产生耐药的细胞，对其他ALK-TKI也表现出较强的附加耐药性，IC50比未经治疗的对照组高5-倍。临床二线治疗药物阿来替尼和劳拉替尼对进化抗性强的环唑替尼有很强的抑制，在体内和体外试验中均可以看到（图B、C）。与逐渐暴露产生的耐药细胞株相似，急性暴露诱导的细胞株耐药表型ALK-TKIs在很大程度上是可遗传的。接下来作者研究erALKTKI细胞对不同ALK抑制剂的交叉敏感性的差异是否由于不同ALK抑制剂的选择，erLor和erAlec细胞对高浓度的不同TKI有更强的抵抗力（图E）。在没有ALK-TKI的情况下，erCriz细胞株中可以看到EML4-ALK磷酸化增加以及STAT3磷酸化增加，但是erLor正相反（图F）。表明获得性抵抗的特异性在使用相同的抑制剂的情况下是类似的。
Result2抗性起源于不同的耐受亚群
获得性抵抗通常反映了一种简单的抗药性亚群扩张，鉴于抗药性表型之间的可预测差异，与不同的ALK-TKI导致获得性抵抗这个概念矛盾，作者接下来进一步直接研究完全性耐药的表型。作者进行了平板克隆实验，接种10天后，对照组形成大量聚集，但是ALK-TKIs给药组的细胞只形成微小菌落（图A）。极限稀释实验显示1:-1:治疗NCI-H细胞可引起在用药后10周内大量生长的耐药菌落（图B-D）。作者通过动态耐药性的显微镜检查从中观察到了耐受性中间体存在明显的弱抗性表型状态。作者引入了DTPs一词来描述EGFR+NSCLC6弱耐药亚群。
Result3ALK-TKI抗性的逐渐发展
接下来作者开始研究肿瘤细胞如何从耐受发展到完全抵抗。在之前的建模、实验和临床认为抗性是通过一次接触引起获得具有抗性的突变或表观遗传转换造成的，其生长速度的二元分布，对应于耐受和抗性细胞在ALK-TKI后的克隆原分析中是可以预测的，暴露时间越长，抗性菌落比例越高（图A）。的确，给药0.5ug的立唑替尼其克隆形成比例从2.6%到26%呈现均匀增长，表明抗性逐渐发展（图B、C）。为了更严格地测试实验数据与单步过渡的兼容性，作者开发了一个基于代理的实验分析数学模型，该模型模拟了在一系列突变概率的克隆基因分析以及突变步骤的数目。作者校准了初始增殖概率仅使用平均菌落大小，假设这些细胞的增殖率有微小的变异。在每一个细胞分裂时，一个细胞的分裂率都会增加，这反映了适应性突变。单元格可以从初始值转换为单个突变的最大分裂概率阶跃或多个阶跃，表示小数单个转换的增量而初始和最大增长率是固定的。作者探索了可能突变概率和变异步骤。作者发现变异步骤为所有人提供最差的适合数据的突变概率。最佳匹配是通过在3-范围内的突变步骤的一个数字实现的。作者得出结论，他的分析与普遍的假设不一致，通过单一突变获得的抗性，它将耐受转化为反抗，并支持治疗过程中细胞适应度的逐步提高（图D-H）。
Result4抗性进化的基础
之前已经有研究ALK-TKIs的抗性机制，主要是抑制剂与ALK的激酶结构域结合减少药物结合。然而，PCR扩增cDNA的靶向Sanger测序结果显示erALK-TKI细胞缺乏ALK突变。作者使用了突变分离荧光原位杂交分析来研究erALK-TKI细胞里ALK的扩增状态，发现部分显示突变等位基因（图A）。erLor细胞不仅缺乏EML4-ALK扩增，且突变等位基因检测不到的细胞比例较高，提示EML4-ALK的基因组缺失在某些情况下是有利的。作者接下来用共表达Cas9的结构物转染了治疗原代erCriz和erLor细胞，发现erCriz细胞未观察到菌落，提示对EML4-ALK有严重依赖性（图C），而erLor细胞形成多个大型菌落且EML4蛋白表达完全消失（图D）。
作者认为可能是由于EML4-ALK扩增导致过度表达是抗性进化的机制，作者逆转录过表达了H细胞中的EML4-ALK蛋白，可以在erALK-TKI细胞中观察到（图E）。但是EML4-ALK过表达也只能观察到环唑替尼实验组耐药，表明ALK过表达只促进抗性（图F）。接下来作者着重于探讨耐药相关突变点LM，表达LM仅部分下调环唑替尼敏感性，这些观察表明突变和过度表达可能需要达到完全抵抗。共同的抗性相关的突变变化，能提供单次抗药性，降低药物敏感性，但不提供对ALK-TKI诱导的选择性压力。
Result5非遗传因素影响抗药性的机制
作者接下来通过RNA测序分析erALK-TKI基因表达的变化,erALK-TKI细胞表现出多种基因表达变化，包括多受体络氨酸激酶表达增加EGFR、HER2、FGFR、AXL、EPHA2等）、细胞因子，细胞外基质（ECM）和ECM受体表达增加（图A）。细胞系共表达分析发现，在erALK-TKI细胞中上调的基因属于不同的基因共表达簇，表明耐药表型不能用单一的协同转录来解释。进一步研究在抗性进化过程中的表型动力学，作者分析了单细胞不同暴露时间后的转录体。UMAP分析显示，即使是短时间的暴露也会对细胞表型产生实质性的影响，表明获得抗性可能反映不仅是药物强制选择的行为，而且是直接的药物诱导的细胞适应。这些结果表明了ALKTKI抗性是多重遗传和表观遗传同时以相加或协同的方式调控的。
讨论
尽管使用靶向作用肿瘤的特殊抑制剂在早期阶段能产生较好的临床结果，但特定的癌细胞群体或许并不会被完全清除，其会对疗法产生耐受性，并且引起肿瘤复发。干扰耐受的产生可能可以大大改善生存结果，但我们对抗性进化的原因和动力学了解仍然较少。现有的抗性研究的框架都存在缺陷，本文作者提出了一种渐进的、多因素的抗性进化方案，整合了现有的两种框架，认为治疗施加的选择性压力作用域表型，通过随机获得的额外遗传和表观遗传变化而达到局部适应峰值。
这篇文章的亮点在于本文研究的抗性进化不仅仅适用于这一类药物，还能将其转化到其他类似的肿瘤治疗中，开创性的讲现有的抗性进化的框架融合成为一种新的机制。接下来作者会更加深入的研究理解肿瘤耐药性的进化轨迹和分子机制，进一步完善理论。
本文于年5月14日在线发表于Nature旗下期刊NatureCommunications，第一作者是RobertVanderVelde，通讯作者为JacobScott和AndriyMarusyk，DepartmentofCancerPhysiology,HLeeMoffittCancerCentreandResearchInstitute和DepartmentofTranslationalHematologyandOncologyResearch为通讯单位。
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